Superstart qPCR Premix plus-UNG
Número de Cat: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG é un reactivo especializado deseñado para reaccións cualitativas e cuantitativas de PCR en tempo real mediante a detección baseada en sondas, desenvolvido especificamente para procesos de liofilización.Contén un novo encima de inicio en quente Hotstart Taq plus (DG), que ten a súa actividade enzimática Taq selada a temperatura ambiente, inhibindo eficazmente a amplificación inespecífica causada polo recocido inespecífico do cebador ou a formación de dímeros de cebador en condicións de baixa temperatura, mellorando así. a especificidade da reacción de amplificación.Este reactivo utiliza un tampón específico para qPCR optimizado e un sistema anti-contaminación UNG/dUTP para conseguir un arranque rápido en quente, mellorando moito a eficiencia e a sensibilidade das reaccións qPCR.Pode obter boas curvas estándar nunha ampla gama de áreas de cuantificación e realizar a cuantificación con precisión, evitando eficazmente a amplificación de falsos positivos causada por produtos de PCR residuais ou contaminación por aerosol.Este reactivo é compatible coa maioría dos instrumentos de PCR cuantitativos fluorescentes de fabricantes como Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad e Roche, etc., e presenta unha boa estabilidade en forma liofilizada.
Composición do reactivo
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratuíto) (DG)
2. 250 mM de MgCl2
3. 4 × lioprotector (opcional)
Condicións de almacenamento
Almacenamento a longo prazo a -20 ℃;pódese almacenar a 4 ℃ ata 3 meses.Mestura ben antes de usar eevitar a conxelación e desconxelación repetidas.
Protocolo de Ciclismo
| Procedemento | Temp. | Tempo | Ciclo |
| Dixestión | 50℃ | 2 min | 1 |
| Activación da polimerase | 95 ℃ | 1 ~ 5 min | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10~20 s | 40-50 |
| Recocido e Extensión | 56 ~ 64 ℃ | 20~60 s | 40-50 |
qPCR Reacción líquida SyPreparación do tallo
|
Composición |
Volume de 25 µl |
Volume de 50 µl |
Concentración final |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+gratuíto) (DG) | 5 µl | 10 µl | 1× |
| 250 mM de MgCl2 | 0,45 µl | 0,9 µl | 4,5 mm |
| 4 × lioprotector1 | 6,25 µl | 12,5 µl | 1× |
| 25 × mestura de cebado-sonda2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| ADN modelo3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Ata 25 µl | Ata 50 µl | —— |
1. Unha concentración final de 0,2μM para cebadores adoita dar bos resultados;cando o rendemento da reacción é pobre, axuste a concentración do cebador dentro do intervalo de 0,2-1 μM segundo sexa necesario.A concentración da sonda normalmente optimízase dentro do intervalo de 0,1-0,3 μM mediante experimentos de gradiente para atopar combinacións óptimas.
2. O número de copias dos xenes diana contidos en diferentes tipos de modelos varía;se é necesario, pódese realizar a dilución en gradiente para determinar a cantidade de adición óptima do modelo.
3. Este sistema pode ser liofilizado;Cando os clientes usan este sistema sen requisitos de secado por congelación, pódense engadir selectivamente 4 lioprotectores; se se precisan produtos liofilizados, durante a validación do rendemento do produto en fase de reactivos líquidos, debe engadir 4 veces lioprotector para garantir a coherencia cos compoñentes do sistema liofilizado. e efectos.
Cando se utiliza o sistemad para liofilizar, preparar o sistema as seguinte:
| Composición | 25µl Sistema de reacción |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratuíto) (DG) | 5 µl |
| 250 mM de MgCl2 | 0,45 µl |
| 4 × lioprotector | 6,25 µl |
| 25 × mestura de cebado-sonda | 1 µl |
| ddH2O | Ata 18 ~ 20 µl |
* Se se necesitan outros sistemas de liofilización, consulte por separado.
Proceso de liofilizaciónss
| Procedemento | Temp. | Tempo | Condición | Presión |
| Preconxelación | 4℃ | 30 min | Manteña |
1 atm |
| -50℃ | 60 min | Refrixeración | ||
| -50℃ | 180 min | Manteña | ||
| Secado primario | -30℃ | 60 min | Calefacción |
O baleiro definitivo |
| -30℃ | 70 min | Manteña | ||
| Secado secundario | 25℃ | 60 min | Calefacción |
O baleiro definitivo |
| 25℃ | 300 min | Manteña |
2. O proceso de liofilización anterior é só para referencia.Os diferentes tipos de produtos e os diferentes liofilizadores teñen diferentes parámetros, polo que se poden facer axustes segundo a realidade.condicións durante o uso.
3. Diferentes procesos de liofilización poden ser axeitados para diferentes tamaños de lotes de liofilizadosprodutos, polo que debe realizarse unha validación de proba suficiente cando se utilice para produción a grande escala.
Instrucións para o uso do liofilizadod en po
1. Centrifugue brevemente o po liofilizado;
2. Engade a plantilla de ácido nucleico ao po liofilizado e engade auga ata 25 µL;
3. Mesturar ben por centrifugación e executar en máquina.
Control de calidade:
1. Probas funcionais: sensibilidade, especificidade, reproducibilidade da qPCR.
2. Sen actividade nuclease esóxena, ningunha contaminación esóxena de endo/exonuclease.
Información técnica:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG usa un novo encima de arranque en quente que permite un arranque rápido en quente en 1 ~ 5 minutos;mediante a formulación de tampón especial é adecuado para reaccións de PCR cuantitativas fluorescentes multiplex.
2. Ten unha maior especificidade que mellora significativamente a sensibilidade da detección de límites de PCR cuantitativa de fluorescencia, facendo normalización das curvas de amplificación, o valor de fluorescencia obtén unha mellora evidente en modelos de baixa concentración, axeitado como reactivos de detección de PCR cuantitativos de fluorescencia de alta sensibilidade.
3. Para cebadores con temperatura de recocido máis baixa ou fragmentos de máis de 200 pb, recoméndase o método de 3 pasos.
4. A eficiencia de utilización do dUTP e a sensibilidade á enzima UNG difiren para os diferentes xenes obxectivo, polo que se o uso do sistema UNG leva a unha diminución da sensibilidade de detección, o sistema de reacción debe ser axustado e optimizado.Se precisa asistencia técnica, póñase en contacto coa nosa empresa.
5. Use áreas e pipetas dedicadas antes e despois da amplificación, use luvas durante o funcionamento e substitúaas con frecuencia;non abra o tubo de reacción despois de completar a PCR para minimizar a contaminación das mostras polos produtos de PCR.
