Proteinase K mNGS (líquido)
A proteinase K é unha serina protease estable cunha ampla especificidade de substrato.Degrada moitas proteínas no estado nativo mesmo en presenza de deterxentes.A evidencia de estudos de estruturas cristalinas e moleculares indica que o encima pertence á familia das subtilisinas cunha tríada catalítica de sitio activo (Asp39-O seu69-Ser224).O sitio predominante de clivaxe é o enlace peptídico adxacente ao grupo carboxilo de aminoácidos alifáticos e aromáticos con grupos alfa amino bloqueados.Úsase habitualmente pola súa ampla especificidade.Esta proteinase K está especialmente deseñada para mNGS.En comparación coa outra proteinase K, contén aínda menos contaminación de ácidos nucleicos co mesmo rendemento enzimático, o que podería garantir mellor a aplicación de mNGS posterior.
Condicións de almacenamento
2-8 ℃ durante 2 anos
Especificación
| Aparición | Líquido incoloro a marrón claro |
| Actividade | ≥800 U/ml |
| Concentración de proteínas | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Non se detectou ningunha |
| DNase | Non se detectou ningunha |
| RNase | Non se detectou ningunha |
Propiedades
| Número CE | 3.4.21.64(Recombinante do álbum Tritirachium) |
| Punto isoeléctrico | 7.81 |
| pH óptimo | 7,0- 12,0 Fig. 1 |
| Temperatura óptima | 65 ℃ Figura 2 |
| Estabilidade do pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Estabilidade térmica | Por debaixo de 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Figura 4 |
| Estabilidade de almacenamento | Máis do 90 % de actividade durante 12 meses a 25 ℃ |
| Activadores | SDS, urea |
| Inhibidores | fluorofosfato de diisopropilo;fluoruro de fenilmetilsulfonilo |
Aplicacións
1. Kit de diagnóstico xenético
2. Kits de extracción de ARN e ADN
3. Extracción de compoñentes non proteicos dos tecidos, degradación de impurezas proteicas, como o ADNvacinas e preparación de heparina
4. Preparación do ADN cromosómico mediante electroforese pulsada
5. Western blot
6. Diagnóstico in vitro de reactivos de albúmina glicosilada enzimática
Precaucións
Use luvas e lentes de protección ao usar ou pesar, e manter ben ventilado despois do uso.Este produto pode causar reaccións alérxicas na pel e irritación ocular grave.Se se inhala, pode causar síntomas de alerxia ou asma ou disnea.Pode causar irritación respiratoria.
Definición da unidade
Unha unidade (U) defínese como a cantidade de encima necesaria para hidrolizar a caseína para producir 1 μmol.tirosina por minuto nas seguintes condicións.
Preparación de reactivos
Reactivo I: 1 g de caseína de leite disoltouse en 50 ml de solución de fosfato de sodio 0,1 M (pH 8,0), incubouse en auga a 65-70 ℃ durante 15 minutos, axitou e disolveuse, arrefriouse con auga, axustouse con hidróxido de sodio a pH 8,0 e volume fixo. 100 ml.
Reactivo II: ácido tricloroacético 0,1 M, acetato sódico 0,2 M, ácido acético 0,3 M.
Reactivo III: 0,4M Na2CO3solución.
Reactivo IV: reactivo Forint diluído con auga pura 5 veces.
Reactivo V: Diluente enzimático: solución de fosfato sódico 0,1 M (pH 8,0).
Reactivo VI: solución de tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml de tirosina disolta con 0,2M HCl.
Procedemento
1. Prequenta 0,5 ml de reactivo I a 37 ℃, engade 0,5 ml de solución enzimática, mestúrase ben e incúbalo a37 ℃ durante 10 minutos.
2. Engade 1 ml de reactivo II para deter a reacción, mestura ben e continúa a incubación durante 30 minutos.
3. Centrifugar a solución de reacción.
4. Tome 0,5 ml de sobrenadante, engade 2,5 ml de reactivo III, 0,5 ml de reactivo IV, mestura ben e incube a 37 ℃durante 30 min.
5. OD660determinouse como OD1;Grupo de control en branco: 0,5 ml de reactivo V úsase para substituír o encimasolución para determinar OD660como OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Curva estándar de L-tirosina: solución de L-tirosina de concentración diferente de 0,5 ml, Reactivo III de 2,5 ml, Reactivo IV de 0,5 ml en tubo de centrífuga de 5 ml, incubar a 37 ℃ durante 30 minutos, detectar OD660para diferentes concentracións de L-tirosina, obtívose a curva estándar Y=kX+b, onde Y é a concentración de L-tirosina, X é OD600.
Cálculo
2: Volume total da solución de reacción (ml)
0,5: volume de solución enzimática (ml)
0,5: volume de líquido de reacción usado na determinación cromoxénica (mL)
10: Tempo de reacción (min)
Df: Dilución múltiple
CConcentración enzimática (mg/ml)
Referencias
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofísica.Res.Comun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Bioquímica.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figuras
Fig.1 Óptimo pH
Solución tampón 100 mM: pH 6,0-8,0, Na-fosfato;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glicina-NaOH. Concentración enzimática: 1 mg/ml
Fig.2 Temperatura óptima
Reacción en tampón K-fosfato 20 mM pH 8,0.Concentración enzimática: 1 mg/ml
Fig.3 pH Estabilidade
25 ℃, 16 h de tratamento con solución tampón 50 mM: pH 4,5-5,5, acetato;pH 6,0-8,0, Na-fosfato;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glicina-NaOH.Concentración enzimática: 1 mg/ml
Fig.4 Térmica estabilidade
30 min de tratamento con tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Concentración enzimática: 1 mg/ml
Fig.5 Almacenamento establety at 25℃
