5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Número de Cat: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) é unha mestura moi estable baseada en sondas dun só tubo adecuada para a transcrición inversa nun paso e a PCR cuantitativa (qRT-PCR).Admite a mestura previa de cebadores e sondas e mantense estable despois de almacenar moito tempo a baixa temperatura.A mostra a probar pode engadirse directamente cando se usa, sen operación adicional de apertura de tubo/pipeta.Este produto proporciona compoñentes, por exemplo, ADN polimerase de inicio en quente, M-MLV, ADN glicosilase de uracilo termolábil (TS-UNG), inhibidor de RNase, MgCl2, dNTPs (con dUTP en lugar de dTTP) e estabilizadores.Coa transcriptase inversa de amplificación rápida modificada xeneticamente e coa ADN polimerase, é posible completar a amplificación por PCR en 20-40 minutos.Este reactivo usa un tampón especial para qPCR con encimas mesturados de encima de amplificación antiinhibidor e encima UNG.Polo tanto, pode obter unha boa amplificación dos xenes diana e evitar a amplificación falsa causada pola contaminación residual da PCR e dos aerosols.Este reactivo é compatible coa maioría dos instrumentos de PCR cuantitativos de fluorescencia de fabricantes como Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad e Roche.
Compoñente
1.25 × Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Condicións de almacenamento
Todos os compoñentes deben manterse a -20 ℃ para almacenamento a longo prazo e 4 ℃ durante ata 3 meses.Mesturar ben despois de desconxelar e centrifugar antes de usar.Evite a conxelación-desconxelación frecuente.
Preparación do sistema de reacción qRT-PCR
| Compoñentes | 25μlSistema | 50μlSistema | Concentración final |
| 5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μl | 10 μl | 1× |
| 25 × Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 μl | 2 μl | 1× |
| 25 × mestura de cebado-sondaa | 1 μl | 2 μl | 1× |
| Modelo RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Ata 25 μL | Ata 50 μL | – |
1) a.A concentración final do cebador adoita ser de 0,2μM.Para obter mellores resultados, a concentración do cebador pódese optimizar dentro do intervalo de 0,2-1 μM.Xeralmente, a concentración da sonda pódese optimizar dentro do intervalo de 0,1-0,3 μM.
2) b.Cando se utiliza un procedemento de PCR rápido, o aumento da concentración de cebadores e sondas pode producir mellores resultados de amplificación e a súa relación debe optimizarse en consecuencia.
3) Os diferentes tipos de mostras conteñen diferentes tipos e contido de inhibidor e número de copias do xene diana.O volume da mostra debe considerarse segundo a condición real.Facer unha dilución da mostra con auga sen nuclease ou tampón TE, se é necesario.
Reacción Ccondicións
| Procedemento de PCR regular | Procedemento rápido de PCR | ||||||
| Procedemento | Temp. | Tempo | Ciclo | Procedemento | Temp. | Tempo | Ciclo |
| Transcrición inversa | 50℃ | 10-20 minutos | 1 | Transcrición inversa | 50℃ | 5 min | 1 |
| Polimerase Activación | 95 ℃ | 1-5 min | 1 | Polimerase Activación | 95 ℃ | anos 30 | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 | Desnaturalización | 95 ℃ | 1-3 segundos | 40-50 |
| Recocido e Extensión | 56-64 ℃ | 20-60 anos | Recocido e Extensión | 56-64 ℃ | 3-20 segundos | ||
Control de calidade
1.Detección de funcións: sensibilidade, especificidade e repetibilidade da qPCR.
2.Sen actividade de nuclease esóxena: non hai contaminación por endonuclease e exonuclease esóxenas.
Notas
1.A taxa de amplificación da ADN polimerase rápida non é inferior a 1 kb/10s.Os diferentes instrumentos de PCR teñen diferentes velocidades de quecemento e arrefriamento, modos de control de temperatura e condutividade térmica, polo que é esencial optimizar a concentración de cebador/sonda e o método de execución en combinación co seu instrumento de PCR rápido específico.
2.Este produto ten unha ampla aplicabilidade e é axeitado para o diagnóstico molecular de alta sensibilidade.Recoméndase o método de PCR en tres pasos para cebadores con baixa temperatura de recocido ou para amplificación de fragmentos longos de máis de 200 pb.
3.Dado que os diferentes amplicóns teñen unha eficiencia de utilización diferente do dUTP e unha sensibilidade diferente a UNG, os reactivos deben optimizarse se a sensibilidade de detección diminúe ao usar o sistema UNG.Póñase en contacto connosco para obter asistencia técnica se é necesario.
4.Para evitar a amplificación dos produtos de PCR transferidos, requírese unha área experimental e unha pipeta dedicadas para a amplificación.Operar con luvas e cambiar con frecuencia e non abrir o tubo de PCR despois da amplificación.
