Proteinase K NGS (en po)
Número de Cat: HC4507A
A NGS Protease K é unha serina protease estable con alta actividade enzimática e ampla especificidade de substrato. O encima descompón preferentemente enlaces éster e enlaces peptídicos adxacentes ao C-terminal de aminoácidos hidrófobos, aminoácidos que conteñen xofre e aminoácidos aromáticos.Polo tanto, úsase a miúdo para degradar proteínas en péptidos curtos.A NGS Protease K é unha serina protease típica coa Asp39-O seu69-Ser224tríada catalítica que é exclusiva das serina proteases, e o centro catalítico está rodeado por estopa de Ca2+sitios de unión para a estabilización, mantendo unha alta actividade enzimática nunha gama máis ampla de condicións.
Especificación
| Aparición | Po amorfo de cor branca a blanquecina, liofilizado |
| Actividade específica | ≥40U/mg sólido |
| DNase | Non se detectou ningunha |
| RNase | Non se detectou ningunha |
| Carga biolóxica | ≤50 CFU/g sólido |
| Residuo de ácido nucleico | <5 pg/mg sólido |
Propiedades
| Fonte | Álbum Tritirachium |
| Número CE | 3.4.21.64(Recombinante do álbum Tritirachium) |
| Peso molecular | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Punto isoeléctrico | 7.81 Fig.1 |
| pH óptimo | 7,0-12,0 (Todos realizan unha actividade elevada) Fig.2 |
| Temperatura óptima | 65℃ Fig.3 |
| Estabilidade do pH | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Estabilidade térmica | Por debaixo de 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig.5 |
| Estabilidade de almacenamento | Almacenado a 25 ℃ durante 12 meses Fig.6 |
| Activadores | SDS, urea |
| Inhibidores | fluorofosfato de diisopropilo;fluoruro de bencilsulfonilo |
Condicións de almacenamento
Almacene o po liofilizado a -25 ~ -15 ℃ durante moito tempo lonxe da luz;Despois da disolución, a alícuota no volume adecuado para almacenamento a curto prazo a 2-8 ℃ lonxe da luz ou almacenamento a longo prazo a -25 ~ -15 ℃ lonxe da luz.
Precaucións
Use luvas e lentes de protección ao usar ou pesar, e manter ben ventilado despois do uso.Este produto pode causar reaccións alérxicas na pel e irritación ocular grave.Se se inhala, pode causar síntomas de alerxia ou asma ou disnea.Pode causar irritación respiratoria.
Definición da unidade
Unha unidade de NGS Protease K defínese como a cantidade de encima necesaria para hidrolizar a caseína en 1 μmol de L-tirosina en condicións de determinación estándar.
Preparación de reactivos
| Reactivo | Fabricante | Catálogo |
| Caseína técnicade leite bovino | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm QuímicaReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2H2O | Sinopharm QuímicaReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm QuímicaReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Ácido tricloroacético | Sinopharm QuímicaReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Acetato de sodio | Sinopharm QuímicaReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Ácido acético | Sinopharm QuímicaReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm QuímicaReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Carbonato de sodio | Sinopharm QuímicaReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folina-fenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co, Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosina | Sigma | 93829 |
Reactivo I:
Substrato: caseína ao 1% da solución de leite bovino: disolver 1 g de caseína de leite bovino en 50 ml de solución de fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0, quentar en baño maría a 65-70 °C durante 15 minutos, remover e disolver, arrefriar con auga, axustado por hidróxido de sodio a pH 8,0 e dilúese en 100 ml.
Reactivo II:
Solución de TCA: ácido tricloroacético 0,1 M, acetato de sodio 0,2 M e ácido acético 0,3 M (pesar 1,64 g de ácido tricloroacético + 1,64 g de acetato de sodio + 1,724 ml de ácido acético sucesivamente, engade 50 ml de auga desionizada, axusta o pH con HC403). 100 ml).
Reactivo III:
Solución de carbonato de sodio 0,4 m (pesar 4,24 g de carbonato de sodio anhidro e disolver en 100 ml de auga)
Reactivo IV:
Reactivo folin fenol: dilúese 5 veces con auga desionizada.
Reactivo V:
Diluente enzimático: solución de fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0.
Reactivo VI:
Solución estándar de L-tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirosina disolta con HCl 0,2M.
Procedemento
1. Acende o espectrofotómetro UV-Vis e selecciona a medición fotométrica.
2. Establece a lonxitude de onda como 660 nm.
3. Acende o baño maria, establece a temperatura a 37 ℃ e asegúrate de que a temperatura non se modifique durante 3-5 minutos.
4. Prequenta o substrato de 0,5 ml nun tubo de centrífuga de 2 ml a 37 ℃ en baño maría durante 10 minutos.
5. Extraer 0,5 ml de solución enzimática diluída no tubo de centrífuga prequentado durante 10 minutos.Establecer o diluyente enzimático como grupo en branco.
6. Engade 1,0 ml de reactivo TCA inmediatamente despois da reacción.Mesturar ben e incubar nun baño maría durante 30 minutos.
7. Centrifugar a solución de reacción.
8. Engade os seguintes compoñentes na orde especificada.
| Reactivo | Volume |
| Sobrenadante | 0,5 ml |
| Carbonato de sodio 0,4 M | 2,5 ml |
| Reactivo folin fenol | 0,5 ml |
9. Mestura ben antes de incubar nun baño maría a 37 ℃ durante 30 minutos.
10. OD660determinouse como OD1;Grupo de control en branco: o diluyente enzimático úsase para substituír a solución enzimática para determinar a DO660como OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Curva estándar de L-tirosina: 0,5 mL de solución de L-tirosina de concentración diferente, 2,5 mL de carbonato de sodio 0,4 M, 0,5 mL de reactivo Folin fenol en tubo de centrífuga de 5 mL, incuba a 37 ℃ durante 30 minutos, detecta OD660para diferentes concentracións de L-tirosina, obtívose a curva estándar Y=kX+b, onde Y é a concentración de L-tirosina, X é OD600.
Cálculo
2: Volume total da solución de reacción (ml)
0,5: volume de solución enzimática (ml)
0,5: volume de líquido de reacción usado na determinación cromoxénica (mL)
10: Tempo de reacción (min)
Df: Dilución múltiple
CConcentración enzimática (mg/ml)
Figuras
Fig.1 Residuo de ADN
| Mostra | Ave C4 | Ácido Nucleico Recuperación (pg/mg) | Recuperación (%) | Nucleico total ácido ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83 % | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O libre de ARN | Indeterminado | — | — | — |
Fig.2 pH óptimo
Fig.3 Temperatura óptima
Fig.4 Estabilidade do pH
Fig.5 Estabilidade térmica
Fig.6 Estabilidade de almacenamento a 25 ℃
