EndoFree Plasmid Maxi Kit
Este kit é axeitado para a extracción de 150 a 300 ml de solución bacteriana cultivada durante a noite, utilizando un método de lise alcalina SDS mellorado para lisar as bacterias.O extracto bruto combínase selectivamente cun exclusivo Endotoxin Scavenger e sepárase por centrifugación para eliminar as endotoxinas.Despois, a membrana de xel de sílice únese selectivamente ao ADN plasmídico da solución en condicións de alto sal e baixo pH.Isto é seguido pola adición de tampón de lavado para eliminar as impurezas e outros compoñentes bacterianos.Finalmente, utilízase un tampón de elución con baixo contido de sal e pH alto para eluir o ADN plasmídico puro da membrana da matriz de silicio.A membrana de xel de sílice emprega unha membrana de adsorción especial, e a diferenza de cantidade de adsorción entre a columna e a columna é moi pequena e a repetibilidade é boa.Non son necesarios fenol, cloroformo e outros reactivos tóxicos, nin tampouco as etapas de precipitación do etanol.Este kit pódese usar para extraer rapidamente 0,2 -1,5 mg de ADN plasmídico puro de alta copia, cunha taxa de extracción do 80% -90%.O kit usa unha fórmula de proceso única que elimina a endotoxina, o contido de endotoxina é extremadamente baixo e o efecto de transfección celular é excelente.O plásmido extraído podería usarse directamente na dixestión enzimática, PCR, transcrición in vitro, transformación, secuenciación e outros experimentos de bioloxía molecular.
Condicións de almacenamento
A RNaseA debe almacenarse a -30 ~ -15 ℃ e transportarse a ≤0 ℃.
Endotoxin Scavenger pódese almacenar a 2 ~ 8 ℃ durante un mes, almacenarse a -30 ~ -15 ℃ para almacenamento a longo prazoe transportado a ≤0℃.
Outros compoñentes deben almacenarse a temperatura ambiente (15 ~ 25 ℃) e transportarse a temperatura ambiente.
Compoñentes
| Compoñentes | 10RXNS |
| RNase A | 750 μl |
| Tampón P1 | 75 ml |
| Tampón P2 | 75 ml |
| Tampón P4 | 75 ml |
| Eliminador de endotoxinas | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Tampón TB | 20 ml |
| Columnas FastPure DNA Maxi (cada un en un tubo de colección de 50 ml) | 10 |
| Tubo de recolección libre de endotoxinas | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, usado para eliminar ARN.
Buffer P1:tampón de suspensión bacteriana, engade RNaseA ao tampón P1 antes do primeiro uso.
Buffer P2:tampón de lise bacteriana (que contén SDS/NaOH).
Buffer P4:tampón neutralizante.
Eliminador de endotoxinas:eliminar eficazmente a endotoxina do extracto de plásmido bruto.
Buffer PW:tampón de lavado, engade o volume estipulado de etanol antes do primeiro uso.
Buffer TB:tampón de elución.
Columnas FastPure DNA Maxi:columnas de adsorción de ADN plasmídico.
Tubos de recollida 50 ml:tubos de recollida de filtrados.
Tubo de recollida sen endotoxinas:tubos de recollida de ADN plasmídico.
Materiais preparados
Etanol absoluto, isopropanol, tubos de centrífuga de fondo redondo de 50 ml e 50 ml libre de endotoxinastubos de centrífuga.
Aplicacións
Este produto é axeitado para a extracción a gran escala de plásmidos de 150 a 300 ml de solución bacterianacultivado durante a noite.
Proceso de experimentación
1. Tome 150 – 200 ml (non máis de 300 ml) de solución bacteriana cultivada durante a noite e centrifugue a temperatura ambiente.aproximadamente 11.000 rpm (12.000 × g) durante 1 – 2 min.Desbotar o sobrenadante e recoller as bacterias.
Δ Cando se recollen máis de 50 ml de solución bacteriana, as bacterias pódense recoller engadindo solución bacteriana, centrifugando, descartando o sobrenadante e outros pasos no mesmo tubo de 50 ml para
varias veces.
2. Engade 7,5 ml de tampón P1 (comproba se se engadiu RNaseA ao tampón P1) á centrífuga.tubo que conteña bacterias e mestúrase ben mediante vórtice ou pipeteo.
Δ A resuspensión completa das bacterias neste paso é fundamental para o rendemento, e non debería haber grupos bacterianos despois da resuspensión.Se hai grumos bacterianos que non se mesturan completamente, afectará á lise, o que resultará nun baixo rendemento e pureza.Se a DO600 da solución bacteriana é 0,65, recoméndase que se utilicen 7,5 ml de tampón P1 ao extraer de 150 ml de solución bacteriana;cando a OD600 é 0,75, deben usarse 8 ml de Buffer P1 e os volumes dos Buffers P2 e P4 deben cambiarse en consecuencia.Se o volume da solución bacteriana aumenta a 200 ml, recoméndase que oo volume dos Buffers P1, P2 e P4 aumente proporcionalmente.
3. Engade 7,5 ml de tampón P2 á suspensión bacteriana do paso 2 e mestura suavemente arriba e abaixo durante 6-8.veces e incubar a temperatura ambiente durante 4-5 min.
Δ Inverte suavemente para mesturar ben.O vórtice provocará a fragmentación do ADN xenómico, dando lugar a fragmentos de ADN xenómico no plásmido extraído.Neste momento, a solución vólvese viscosa e translúcida, o que mostra que as bacterias foron totalmente lisadas.A duración non debe superar os 5 min para evitar a destrución dos plásmidos.Se a solución non está clara, pode haber demasiadas bacteriaslise incompleta, polo que a cantidade de bacterias debe reducirse adecuadamente.
4. Engade 7,5 ml de tampón P4 á suspensión bacteriana do paso 3 e invírtese inmediatamente suavemente 6 – 8 veces para permitir que a solución neutralice completamente o tampón P2.Neste momento, debe aparecer un precipitado floculento branco.Centrifugue a máis de 11.000 rpm (12.000 × g) durante 10 – 15 min, pipetee coidadosamente o sobrenadante nun novo tubo de centrífuga de fondo redondo de 50 ml (autopreparado) e eviteaspirar o precipitado branco flotante.
Δ Engade o tampón P4 e inverte inmediatamente para mesturar ben.Deixar repousar o tubo ata que o precipitado branco se distribúa uniformemente por toda a solución para evitar a produción de precipitacións locais que poidan afectar á neutralización.Se non hai un precipitado floculento branco uniforme antes da centrifugación e o sobrenadante non está claro despois da centrifugación, o tubo pódesecentrifugar durante 5 min máis.
5. Engade 0,1 veces o volume (10% do volume do sobrenadante, uns 2,2 ml) de Endotoxin Scavenger ao sobrenadante do paso 4 e inverte para mesturar.Coloque a solución nun baño de xeo ou introduza no xeo picado (ou no frigorífico conxelador) durante 5 minutos ata que a solución cambie de turbia a clara e transparente (ou aínda).lixeiramente turbio), e ocasionalmente mestura varias veces.
Δ Despois de engadir o eliminador de endotoxinas ao sobrenadante, o sobrenadante quedará turbio pero oo sobrenadante debe quedar claro (ou lixeiramente turbio) despois de arrefriar no baño de xeo.
6. Despois de que o sobrenadante se coloque a temperatura ambiente (>25 ℃) durante 10 – 15 min, quedará turbio comoa súa temperatura aumenta ata a temperatura ambiente.A continuación, o sobrenadante debe ser invertido para mesturar.
Δ Se a temperatura ambiente é máis baixa ou se desexa reducir o tempo de extracción, o sobrenadante pódese incubar nun baño de auga a 37 ~ 42 ℃ durante 5-10 minutos e o seguinte paso pódese realizar despois do sobrenadante.vólvese turbio.
7. Centrifuga o sobrenadante a unhas 11.000 rpm (12.000 × g) durante 10 min a temperatura ambiente (a temperatura debe ser >25 ℃) para separar a fase.A fase acuosa superior contén o ADN mentres que a capa inferior de fase oleosa azul contén endotoxinas e outras impurezas.Transferir oFase acuosa que contén ADN a un novo tubo edescartar a capa oleosa.
Δ A temperatura durante a centrifugación debe ser superior a 25 ℃ xa que a separación de fases efectiva non o faiocorre se a temperatura é demasiado baixa.
Δ Se a separación de fases non é efectiva, a temperatura de centrifugación pódese axustar a 30 ℃ eo tempo de centrifugación pódese aumentar a 15 min.
Δ Non chupe a capa oleosa azul xa que contén endotoxinas e outras impurezas.
Mecanismo
Resuspensión Lisis Neutralización
◇ Engadir 7,5 ml de tampón P1
◇ Engadir 7,5 ml de tampón P2
◇ Engadir 7,5 ml de tampón P4
Eliminación de endotoxinas
◇Engade 0. 1 veces o volume de sobrenadante de Endotoxin Scavenger
Encadernación e lavado
◇ Engadir 0,5 veces o volume de isopropanol
◇ Engadir 10 ml de tampón PW
◇ Engadir 10 ml de tampón PW
Elución
◇ Engade 1 – 2 ml de tampón TB ou ddH2O libre de endotoxinas
