Mini kit de extracción de ADN
Este kit adopta un sistema de tampón optimizado e tecnoloxía de purificación da columna de xel de sílice, que pode recuperar fragmentos de ADN de 70 pb - 20 kb de varias concentracións de xel de agarosa TAE ou TBE.A columna de adsorción de ADN pode adsorber especialmente o ADN en condicións de alto contido de sal.Ademais, o kit pode purificar directamente fragmentos de ADN de produtos de PCR, sistemas de reacción enzimática ou produtos de ADN bruto obtidos por outros métodos, e eliminar impurezas como proteínas, outros compostos orgánicos, ións salinos inorgánicos e cebadores de oligonucleótidos.Pode garantir que a purificación pode completarse en 10-15 minutos.O ADN purificado pódese usar directamente para a ligadura, transformación, dixestión enzimática, transcrición in vitro, PCR, secuenciación, microinxección, etc.
Condicións de almacenamento
Almacenar a -15 ~ -25 ℃ e transportar a temperatura ambiente.
Compoñentes
| Compoñentes | (100 rxns) |
| PIB tampón | 80 ml |
| Tampón GW | 2 × 20 ml |
| Tampón de elución | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
PIB amortiguador:Tampón de unión ao ADN.
Buffer GW:Tampón de lavado;engadir etanol absoluto polo volume indicado na botella antes do uso.
Tampón de elución:Elución.
FastPure DNA Mini Columns-G:Columnas de adsorción de ADN.
Tubos de recollida 2 ml:Tubos de recollida para filtrado.
Materiais preparados
Tubos esterilizados de 1,5 ml, etanol absoluto e isopropanol (cando o fragmento de ADN ≤100 pb, engadir 1 volume).
isopropanol a 1 volume de xel), baño maría.
Proceso de experimentación
Engade 80 ml de etanol para diluír o Buffer GW tal e como se indica na etiqueta antes do uso, almacénase a temperatura ambiente.
Mecanismo
1. Solución de reacción PCR
Esquema de extracción en xel: Engadir un volume igual Tampón GDP Esquema de recuperación da solución de reacción PCR:Engade 5 veces o volume Buffer
2. PIB Calcula o volume de xel (100 μl é igual a 100 mg)
Disolver o xel
3. Prequentar a 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Engade 300 μl de buffer GDP*
Engade 700 μL de Buffer GW
Engade 700 μL de Buffer GW
5. Eluir
Engade 20 – 30 μl de tampón de elución ou auga desionizada
Notas* Recuperación do fluído da reacción PCR sen este paso
Programa de extracción de gel
1. Despois da electroforese de ADN para fraccionar fragmentos de ADN, escinte a única franxa do fragmento de ADN do xel de agarosa baixo luz UV.Recoméndase usar papel absorbente para absorber a humidade aparente do xel e minimizar o tamaño da porción de xel eliminando o máis posible a agarosa.Pese a porción de xel (sen tubo de microcentrífuga) para calcular o seu volume: o volume de 100 mg de porción de xel é de aproximadamente 100 μL, supoñendo que a densidade é de 1 g/ml.
2. Engade igual volume Buffer GDP, incuba a 50 ~ 55 ℃ durante 7-10 min (segundo o tamaño do xel, axusta o tempo de incubación ata que o xel se disolva completamente).Inverte o tubo 2 veces durante a incubación.
Δ A adición de 1-3 volumes de Buffer GDP non influirá na eficiencia da recuperación do ADN.Se o fragmento de ADN que se vai recuperar <100 pb, hai que engadir 3 volumes de Buffer GDP;cando a porción de xel se disolveu por completo, engade 1 volume de isopropanol e mestúrase ben e, a continuación, continúe co seguinte paso.
3. Centrifugue brevemente para levar a mostra ao fondo do tubo, introduza as FastPure DNA Mini Columns-G nos tubos de recollida de 2 ml, transfire coidadosamente a solución como máximo de 700 μL unha vez por día.
tempo ata as columnas de filtración, centrifugar a 12.000 rpm (13.800 X g) durante 30-60 seg.
4. Desbotar o filtrado e engadir 300 μL de Buffer GDP á columna, incubar a temperatura ambiente durante 1 min, centrifugar a 12.000 rpm (13.800 X g) durante 30-60 seg.
5. Desbotar o filtrado e engadir 700 μL de Buffer GW (comprobar se se engadiu etanol absoluto previamente!) á columna, centrifugar a 12.000 rpm (13.800 X g) durante 30-60 seg.
Δ Engade Buffer GW ao redor da parede da columna de adsorción ou engade a tapa traseira de Buffer GW e mestúrao boca abaixo 2 ou 3 veces para axudar a eliminar completamente o sal que se adhire á parede do tubo.
6. Repita o paso 5.
Δ O lavado con Buffer GW dúas veces pode garantir que o sal sexa completamente eliminado e eliminar o impacto nos experimentos posteriores.
7. Desbotar o filtrado e centrifugar a columna baleira a 12.000 rpm (13.800 X g) durante 2 min.
8. Insira a columna nun tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 ml, engade 20 - 30 μL de tampón de elución ao centro da membrana da columna, incube durante 2 min e, a continuación, centrifugue a 12.000 rpm (13.800 X g) durante 1 min.Desbotar a columna, almacenar o ADN obtido a -20 .
Δ Transferir o sobrenadante do paso 8 á columna para eluír de novo e prequentar o tampón de elución a 55 (cando o fragmento de ADN > 3 kb) pode ser útil para aumentar a eficiencia da recuperación.
Programa de recuperación de produtos PCR
Este protocolo é aplicable para purificar fragmentos de ADN de produtos de PCR, sistema de reacción enzimática e outros produtos brutos de ADN (incluído o ADN xenético).Esta solución pode eliminar eficazmente varios nucleótidos, cebadores, dímeros de cebadores, moléculas de sal, encimas e outras impurezas.
1. Centrifugue brevemente os produtos de PCR, a solución de reacción enzimática e outros produtos brutos de ADN.Estimar o seu volume con pipeta e transferir a un tubo esterilizado de 1,5 ml ou 2 ml.Engade ddH2O ata que o volume ata 100 μL;mentres que para o ADN xenómico con alta concentración, diluír ata 300 μL con ddH2O axudará a mellorar a eficiencia da recuperación.
2. Engade 5 volumes de Buffer GDP, mestura ben invertendo ou agitando en vórtice.Se o fragmento de ADN de interese >100 pb, hai que engadir 1,5 volumes adicionais (mostras + GDP tampón) de etanol.
3. Insira de novo a columna no tubo de recollida, transfira a mestura verdadeira á columna, centrifugue a 12.000 rpm (13.800 ×g) durante 30 – 60 seg.Se o volume da solución mesturada é > 700 µl, coloque a columna de adsorción de novo no tubo de recollida, transfira a solución restante á columna de adsorción e centrifugue a 12.000 rpm (13.800 × g) durante 30 – 60 segundos.
4. A seguinte actuación refírese ao paso 5 - 8 do programa de extracción 08- 1/Gel.
Aplicacións
Varias concentracións de xel de agarosa TAE ou TBE;Produtos de PCR, sistemas de reacción enzimática ou outros produtos de ADN bruto obtidos por diversos métodos.Os fragmentos recuperados foron de70 pb -20 kb.
Notas
Só para uso de investigación.Non para o seu uso en procedementos de diagnóstico.
1. Engade 80 ml de etanol para diluír o Buffer GW tal e como se indica na etiqueta antes do uso, almacénase a temperatura ambiente.
2. Se o Buffer GDP é fácil de precipitar durante o almacenamento a baixa temperatura, pódese colocar a temperatura ambiente durante un período de tempo antes do seu uso.Se é necesario, pódese prequecer nun baño de auga a 37 ℃ ata que o precipitado estea completamente disolto, e despois pódese usar despois da mestura.
3. Establece a temperatura do baño de auga a 50 ~ 55 ℃ con antelación.
4. No paso 1 do programa de extracción 08-1/Gel, minimizar o tamaño da porción de xel reducirá significativamente o tempo de disolución e aumentará a eficiencia de recuperación (o ADN linealizado é fácil de hidrolizar cando se expón continuamente a alta temperatura).Non expoña o xel de ADN aos UV durante moito tempo, xa que a luz ultravioleta pode causar danos no ADN.
5. Disolver completamente o xel no paso 2 do programa de extracción 08- 1/Gel, se non, a eficiencia da recuperación do ADN verase seriamente afectada.
6. Prequentar o tampón de elución ou ddH2O a 55 ℃, o que é útil para mellorar a eficiencia da elución do ADN.Recoméndase almacenar o ADN nun eluyente de Tris-HCl 2,5 mM, pH 7,0 – 8,5.
