ADN glicosilase de uracilo
Uracilo-ADN glicosilase (UNG ou UDG) é un clon recombinante de E.coli cun peso molecular de 25 kDa.Cataliza a liberación de uracilo libre do ADN monocatenario e bicatenario que contén uracilo, e é inactivo contra o ARN e pódese usar para evitar a contaminación dos produtos de amplificación da PCR.O principio de acción baséase no feito de que se se substitúe dUTP por dTTP na reacción de PCR e se forma un produto de amplificación da PCR que contén bases dU, o encima pode romper selectivamente o enlace glicosídico das bases U en cadea simple e dobre cadea. ADN e degradar o produto de amplificación da PCR.
Aplicación recomendada
Amplificación da prevención da contaminación
Condición de almacenamento
-20 °C para almacenamento a longo prazo, debe mesturarse ben antes do seu uso, evitando conxelación e desconxelación frecuentes.
Buffer de almacenamento
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, estabilizador, glicerol ao 50 %.
Definición da unidade
A cantidade de encima necesaria para degradar 1 µg de ADN monocatenario que contén bases dU en 1 hora a 37 °C é de 1 unidade.
Control de calidade
1.Pureza electroforética SDS-PAGE superior ao 98%
2.Sensibilidade de amplificación, control de lote a lote, estabilidade
3.Despois de que 1U de UNG se trate a 50 ℃ durante 2 minutos, o modelo que contén U por debaixo de 103 copias debería degradarse completamente e non se pode producir ningún produto de amplificación.
4.Sen actividade nuclease esóxena
Instrucións
| Compoñentes | Volume (μl) | Concentración final |
| 10 × PCR Buffer (libre de dNTP, Mg²+gratuíto) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (substituír dTTP) | - | 200-600 μM |
| MgCl 25 mM2 | 2-8 μl | 1-4 mm |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × mestura de imprimacióna | 2 | 1× |
| Modelo | - | <1 μg/reacción |
| ddH₂O | Ata 50 | - |
Nota: a: Se se usa para qPCR/qRT-PCR, a sonda fluorescente debe engadirse ao sistema de reacción.Normalmente, unha concentración final de cebador de 0,2 μM pode dar bos resultados;cando o rendemento da reacción é pobre, a concentración do cebador pódese axustar no intervalo de 0,2-1 μM.Normalmente, a concentración da sonda está optimizada no intervalo de 0,1-0,3 μM.Pódense realizar experimentos de gradiente de concentración para atopar a mellor combinación de cebador e sonda.
Notas
1.O encima UNG pode usarse para eliminar os produtos de amplificación dUTP contaminados do sistema de reacción antes da reacción de amplificación por PCR, para evitar resultados falsos positivos debido á contaminación do produto.
2.A temperatura óptima para que a enzima UNG se use na reacción de PCR anticontaminación é xeralmente de 50 ℃ durante 2 minutos;a condición de inactivación é de 95 ℃ durante 5 minutos.
3.Evite a conxelación-desconxelación frecuente e non expoña a grandes flutuacións de temperatura.
4.Os diferentes xenes a amplificar teñen unha eficiencia de utilización diferente do dUTP e a sensibilidade ao encima UNG, polo tanto, se o uso do sistema UNG conduce a unha diminución da sensibilidade de detección, o sistema de reacción debe axustarse e optimizarse; se precisa asistencia técnica, póñase en contacto nosa empresa.
