2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Número de Cat: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) está deseñado para realizar PCR directamente a partir de mostras sen extracción de ADN nin preparación de mostras.Este reactivo consiste en ADN polimerase de inicio en quente, ADN glicosilase de uracilo (UNG), inhibidor de RNase, MgCl2, dNTPs (con dUTP en lugar de dTTP) e estabilizadores, para PCR cuantitativa (qPCR).Este reactivo preforma unha alta tolerancia aos inhibidores e, polo tanto, pódese aplicar directamente á detección de mostras como cotonete de garganta, saliva, sangue total anticoagulado, plasma e soro sen extracción de ADN.O reactivo usa un tampón patentado para qPCR con encimas mixtos de ADN polimerase antiinhibitoria e encima UNG.Polo tanto, pode obter unha boa amplificación dos xenes diana en mostras que conteñen inhibidores e inhibir a amplificación de falsos positivos causada pola contaminación residual da PCR e dos aerosols.Este reactivo é compatible coa maioría dos instrumentos de PCR cuantitativos fluorescentes, como Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche, etc.
Compoñentes
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×Buffer de premestura SensiDirect (dUTP)
Condicións de almacenamento
Todos os compoñentes deben manterse a -20 ℃ para almacenamento a longo prazo e 4 ℃ durante ata 3 meses.Mesturar ben despois de desconxelar e centrifugar antes de usar.Evite a conxelación-desconxelación frecuente.
Protocolo de Ciclismo
| Paso | Temperatura | Tempo | Ciclo |
| Dixestión | 50℃ | 2 min | 1 |
| Activación da polimerase | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 |
| Recocido/Extensión | 56-64 ℃ | 20-60 anos |
Instrucións de pipeteo
| Reactivo | Volume por reacción | Volume por reacción | Concentración final |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µl | 25 µl | 1× |
| 50 × SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 µl | 1 µl | 1× |
| 25 × mestura de cebado-sonda1, 2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| Mostra3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Volume total | 25 μl | 50 μl | - |
1. A concentración final do cebador adoita ser de 0,2 μM.Para obter mellores resultados, a concentración do cebador pódese optimizar dentro do intervalo de 0,2-1 μM.
2. Xeralmente, a concentración da sonda pódese optimizar dentro do intervalo de 0,1-0,3μM.A concentración óptima da sonda está relacionada co instrumento de amplificación da PCR en tempo real, o tipo de sonda e o tipo de substancia de marcado fluorescente.Consulte o manual do instrumento ou os requisitos específicos de cada sonda fluorescente.
3. Os diferentes tipos de mostras conteñen diferentes tipos e contido de inhibidor e número de copias do xene diana.O volume da mostra debe considerarse segundo a condición real.Fai unha dilución da mostra engadindo auga sen nuclease ou tampón TE, se é necesario.
4. Volume recomendado de diferentes mostras:
| Mostra | Volume para un 50 μl reacción | Máximo proporción |
| Sangue total anticoagulado | 2,5 μl | 5% |
| Plasma | 15 μl | 30 % |
| Soro | 10 μl | 20 % |
| Hisopo de garganta | 10 μl | 20 % |
| Saliva | 10 μl | 20 % |
Control de calidade
1. Detección de funcións: sensibilidade, especificidade e repetibilidade da qPCR.
2. Sen actividade de nuclease esóxena: non hai endonuclease esóxena e contaminación por exonuclease.
Notas do produto
1. Este produto emprega un novo tipo de ADN polimerase de inicio en quente, que se pode activar en 1-5 minutos. Dado que o seu tampón de reacción foi optimizado, é máis axeitado para a PCR cuantitativa de fluorescencia dobre ou múltiple mediante o método de sonda.
2. Se o valor de Rn da amplificación da PCR é demasiado baixo ou a amplificación está obviamente inhibida, a diminución da cantidade de mostra, o aumento do volume de reacción ou a dilución previa da mostra poden mellorar os resultados.
3. A recollida de sangue, saliva, orina, cotonete de garganta, etc. debe seguir os requisitos dos criterios clínicos, e pódese usar mostra fresca para evitar a degradación do ácido nucleico.
4. Dado que os distintos amplicóns teñen unha eficiencia de utilización diferente ao dUTP e sensibilidade ao UNG, os reactivos deben optimizarse se a sensibilidade de detección diminúe ao usar o sistema UNG.Póñase en contacto connosco para obter asistencia técnica se é necesario.
5. Para evitar a amplificación dos produtos de PCR de arrastre entre as reaccións dun paso, requírese unha área experimental e unha pipeta dedicadas para a amplificación.Operar con luvas e cambiar con frecuencia e non abrir o tubo de reacción despois da amplificación por PCR.
