Transcriptase inversa RTL
A transcriptase inversa RTL é unha ADN polimerase dependente do molde de ARN que carece da actividade exonuclease 3'→5' e ten actividade da RNase H.Este encima pode usar ARN como molde para sintetizar unha cadea complementaria de ADN, que se pode aplicar á síntese de ADNc da primeira cadea, especialmente para RT-LAMP (amplificación isotérmica mediada por bucle).En comparación coa transcriptase inversa RTL 1.0, a sensibilidade mellora significativamente, a estabilidade térmica é máis forte e a reacción a 65 °C é máis estable.A transcriptase inversa RTL (sen glicerol) pódese usar para preparar preparacións liofilizadas, reactivos RT-LAMP liofilizados, etc.
Definición da unidade
Unha unidade incorpora 1 nmol de dTTP en material precipitable con ácido en 20 minutos a 50 °C utilizando poli(A)•oligo(dT)25 como imprimación molde.
Compoñentes
| Compoñente | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Transcriptase inversa RTL (sen glicerol) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Condición de almacenamento
Transporte a menos de 0 °C e almacénase a -25 °C ~ -15 °C.
Control de calidade
- Actividade Residual deEndonuclease:Unha reacción de 50 μL que contén 1 μg de λDNA e 15 unidades de RTL2.0 incubadas durante 16 horas a 37 ℃ mostra o mesmo patrón que o control negativo mediante electroforese en xel.
- Actividade Residual deExonuclease:Unha reacción de 50 μL que contén 1 μg de λDNA dixerido con Hind Ⅲ e 15 unidades de RTL2.0 incubadas durante 16 horas a 37 ℃ mostra o mesmo patrón que o control negativo mediante electroforese en xel.
- Actividade Residual deNickase:Unha reacción de 50 μL que contén 1 μg de pBR322 superenrollado e 15 unidades de RTL2.0 incubadas durante 4 horas a 37 °C mostra o mesmo patrón que o control negativo mediante electroforese en xel.
- Actividade Residual deRNase:Unha reacción de 10 μL que contén 0,48 μg de ARN MS2 e 15 unidades de RTL2.0 incubadas durante 4 horas a 37 °C mostra o mesmo patrón que o control negativo mediante electroforese en xel.
- E. coli gADN:Medido conE.colikits específicos de detección de HCD, 15 unidades de RTL2.0 contén menos de 1E. colixenoma.
Configuración de reacción
Protocolo de síntese de cDNA
| Compoñentes | Volume |
| Modelo RNA a | opcional |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) ou mestura aleatoria de imprimación (60uM) | 2 μl |
| dNTP Mix (10 mM cada un) | 1 μl |
| Inhibidor de RNase (40U/uL) | 0,5 μl |
| Transcriptase inversa RTL 2.0 (15U/ul) | 0,5 μl |
| 10 × HC RTL Buffer | 2 μl |
| Auga sen nucleasas | Ata 20 μL |
Notas:
1) A dosificación recomendada de ARN total é de 1ng ~ 1μg
2) A dosificación recomendada de ARNm foi de 50ng ~ 100ng
Termo-andar en bicicleta Condicións para unha rutina reacción:
| Temperatura (°C) | Tempo |
| 25 °Ca | 5 min |
| 55 °C | 10 minutosb |
| 80 °C | 10 minutos |
Notas:
1) Se se usa Random Primer Mix, un paso de incubación a 25 °C.
2) Se se usa a mestura de cebadores obxectivo, unha etapa de incubación a 55 °C durante 10 ~ 30 minutos.
Protocolo RT-LAMP
| Compoñentes | Volume | Concentración final |
| Modelo RNA | opcional | ≥10 copias |
| Mestura dNTP (10 mM) | 3,5 μl | 1,4 mm |
| Imprimacións FIP/BIP (25×) | 1 μl | 1,6 μM |
| Imprimacións F3/B3 (25×) | 1 μl | 0,2 μM |
| Cebadores LoopF/LoopB (25×) | 1 μl | 0,4 μM |
| Inhibidor de RNase (40U/μL) | 0,5 μl | 20 U/Reacción |
| Transcriptase inversa RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 μl | 7,5 U/Reacción |
| ADN polimerase Bst V2 (8U/μL) | 1 μl | 8 U/Reacción |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μl | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10 × HC RTL Buffer (ou 10 × HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μl | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Auga sen nucleasas | Ata 25 μL | - |
Notas:
1) Mesturar mediante vórtex e centrifugar brevemente para recoller.Incubación a temperatura constante a 65 °C durante 1 hora.
2) Os dous buffers son interoperables e teñen a mesma composición.
Notas
1.Este produto formará un sólido branco cando se almacena a -20 °C.Retírao a -20 °C e colócao en xeo uns 10 minutos.Despois de derreter, pódese usar axitando e mesturando.
2.O produto de ADNc pódese almacenar a -20 °C ou -80 °C ou usar inmediatamente para a reacción de PCR.
3.Para evitar a contaminación por RNase, manteña limpa a área experimental e use luvas e máscaras limpas durante a operación.
