Kit de PCR directa de plantas
Número de Cat: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit é axeitado para a amplificación directa de follas de plantas, sementes, etc., e pódese usar para a selección de alto rendemento de mostras de plantas que non conteñan polisacáridos e polifenois.A ADN polimerase de amplificación directa baseada na evolución dirixida ten unha tolerancia superior aos inhibidores da PCR nas plantas.Mentres tanto, mantén o alto rendemento de amplificación, que é adecuado para a amplificación de fragmentos de ADN dentro de 5 kb.O único tampón de lise A do kit pódese usar para lisar tecidos vexetais frescos ou conxelados.É fácil de operar e o lisado pódese usar como modelo para amplificación sen purificación.O sistema contén axentes protectores que permiten que as mostras en bruto sexan efectivamente amplificadas despois de repetidas conxelacións e desconxelacións.2 × Plant Direct Master Mix só precisa engadir cebadores e modelos para realizar a reacción de amplificación, reducindo así as operacións de pipeteo e mellorando o rendemento de detección e a reproducibilidade dos resultados.
Compoñentes
| Compoñentes | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Mix directo de plantas | 1,25 ml | 4 × 1,25 ml |
| Tampón de lise directa das plantas A | 5 ml | 20 ml |
| Tampón de lise directa da planta B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Buffer B é un reactivo opcional, que se usa para neutralizar Plant Direct Lysis Buffer A para prolongar o tempo de almacenamento das mostras.Pódese usar segundo a situación real.
Condicións de almacenamento
2 × Plant Direct Master Mix, almacénase a -30 ~ -15 ℃ e evite a conxelación e desconxelación repetidas;Tampón de lise directa da planta, almacénase a -30 ~ -15 ℃ ou 2 ~ 8 ℃.
Proceso de experimentación
Procesamento da mostra–Folla da Planta
Método directo:Recoméndase usar follas novas.Use unha perforadora cun diámetro fixo de 0,5 a 3 mm para obter unha mostra pequena e uniforme e, a continuación, engada directamente a mostra ao sistema de PCR (recoméndase un sistema de 50 μl).Teña en conta que a mostra está na solución de PCR e non contra a parede do tubo.Se se utiliza a PCR directa para amplificar fragmentos longos e mostras complexas, usar unha mostra cun diámetro menor (0,5 – 1 mm) como modelo pode axudar a obter mellores resultados.
Método de lise de moenda:Recoméndase usar follas novas.Colle un pequeno anaco de folla (de 1 a 3 mm de diámetro), colócao en 20 μl de Plant Direct Lysis Buffer Ab e tritúrao o máximo posible (este paso pódese facer apretando a folla cunha punta de pipeta de 100 μl). para macerar a mostra).Se se usan volumes maiores de tecido foliar (non superen os 7 mm), aumente o volume de tampón de dilución a 50 μl.Despois de moer as follas, a solución debe aparecer verde.Despois dunha breve centrifugación, engade 1 μl do sobrenadante ao sistema de PCR como modelo de reacción.
Método de lise térmica:Recoméndase usar follas novas.Tome un pequeno anaco de folla (uns 1 – 3 mm de diámetro), colócao en 20 μl de tampón de lisis directa da planta A e quéntao a 95 °C durante 5 – 10 min.O tempo de lise pódese prolongar adecuadamente para follas difíciles de lisar (non máis de 20 min).Se se usan volumes maiores de tecido foliar (non superen os 7 mm), aumente o volume de tampón de dilución a 50 μl.Despois de quentar, centrifugar brevemente e engadir 1 μl de sobrenadante ao sistema de PCR como modelo de reacciónb.
Procesamento da mostra- Semente de plantas
Método de lise de moenda:Use un bisturí para cortar sementes cun diámetro de 5 mm, engádeas a 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A e tritura a mostra cunha punta de pipeta ou outras ferramentas.Agitar brevemente e deixar repousar a temperatura ambiente durante 3-5 min.Asegúrese de que a mostra de semente estea mergullada no tampón de dilución.Despois dunha breve centrifugación, engade 1 μl do sobrenadante ao sistema de PCR como molde de reacción.
Método de lise térmica:Use un bisturí para cortar sementes cun diámetro de 5 mm, engádeas a 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A e quenta a 95 °C durante 5 – 10 min.O tempo de lise pódese prolongar adecuadamente para follas difíciles de lisar (non máis de 30 min).Despois de quentar, centrifugar brevemente e engadir 1 μl de sobrenadante ao sistema de PCR como modelo de reacciónb.
a.Tamén se poden usar tesoiras ou outras ferramentas para cortar mostras de tamaño axeitado;se se reutilizan o punzón ou as tesoiras, deben limparse con solución de hipoclorito sódico ao 2% antes de cada uso para evitar a contaminación cruzada entre as mostras.
b.Asegúrese de que o tampón de lisis directa da planta estea completamente derretido antes de usar.Se o tampón é viscoso ou ten precipitados, pódese quentar a 37 ℃ para fundilo completamente antes de usar.
c.O volume de plantilla no sistema de reacción pódese axustar adecuadamente segundo a diferenza no volume de material vexetal e de diluyente engadido.
Tampón de lise directa da planta
O tampón A de lise directa das plantas contido neste produto foi estritamente optimizado para liberar o xenoma da maioría dos tecidos vexetais e é axeitado para o almacenamento a curto prazo de plantas en bruto a 4 ℃.Se a mostra debe almacenarse durante un período de tempo máis longo (por exemplo, 1-2 meses), recoméndase transferir o sobrenadante a un novo tubo EP e almacenalo a -20 ℃.Para almacenar as mostras de forma máis estable, engade un volume igual de tampón de lise directa da planta B ao sobrenadante transferido, mestura ben e gárdao a -20 ℃.O tempo de almacenamento estable varía segundo as mostras e estados das plantas.
Sistema de reacción
| ddH2O | Ata 20,0 µl | Ata 50,0 µl |
| 2 × Mix directo de plantasa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Cebador 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Cebador 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Mostra de folla de planta/extracto bruto(Consulte Procesamento da mostra) | Disco de folla de 0,5 – 3 mm/x µl | Disco de folla de 0,5 – 3 mm/x µl |
a.Contén Mg2+a unha concentración final de 2 mM.
b.Recoméndase utilizar unha concentración final de 0,4 μM para cada imprimación.O uso excesivo de cebadores levará a un aumento da amplificación inespecífica.
c.A cantidade de mostra utilizada pódese axustar segundo a situación real.A cantidade utilizada nunha única reacción de mostra bruta lisada pódese axustar entre un 2% e un 20% do volume total da reacción.Usar demasiadas mostras pode provocar un fallo de amplificación.
Programa de reacción
| Pasos | Temperatura | Tempo |
| Desnaturalización inicial | 98 ℃ | 5 min |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10 seg |
| Recocido | 58 ~ 72 ℃ | 15 seg |
| Extensión | 72 ℃ | 30 seg |
| Ampliación Final | 72 ℃ | 5 min |
a.A desnaturalización inicial (98 ℃, 5 min) promove a lise do tecido vexetal, liberando ADN xenómico que se pode usar para a amplificación por PCR.Non acurtar o tempo nin diminuír a temperatura.
b.Recoméndase axustalo igual ao valor Tm do cebador ou 2 ~ 4℃ superior ao valor Tm.A ADN polimerase de amplificación directa utilizada neste produto é diferente da ADN polimerase Taq convencional e ten requisitos especiais para a temperatura de recocido da reacción; o uso de alta temperatura de recocido pode reducir eficazmente a amplificación inespecífica e mellorar a eficiencia da amplificación.Para modelos complexos, a amplificación eficiente pódese conseguir axustando a temperatura de recocido e prolongando o tempo de extensión.
c.Se a lonxitude do produto de amplificación é ≤1 kb, o tempo de extensión establécese en 30 seg/kb;se a lonxitude do produto de amplificación é >1 kb, o tempo de extensión establécese en 60 seg/kb.
d.Para mostras complexas ou mostras con baixo rendemento de amplificación, o número de ciclos pódese aumentar adecuadamente ata 40 -50 ciclos.
Aplicacións
É aplicable para a amplificación directa de tecidos vexetais e o cribado de alto rendemento de mostras vexetais que non conteñan polisacáridos e polifenois.
Notas
Só para uso de investigación.Non para o seu uso en procedementos de diagnóstico.
1. Para a amplificación de plantas en bruto ou a amplificación directa, recoméndase utilizar ADN xenómico purificado como control positivo antes de comezar o experimento para garantir que o sistema, os cebadores e as operacións son correctos.
2. A ADN polimerase de amplificación directa utilizada neste kit ten unha forte actividade de corrección de probas.Se é preciso realizar a clonación de TA, recoméndase purificar o ADN antes de engadir a adenina.
3. Orientación para o deseño de imprimacións:
a.Recoméndase que a última base no extremo 3′ do cebador sexa G ou C.
b.Deben evitarse os desaxustes consecutivos nas últimas 8 bases no extremo 3′ do cebador.c.Evite as estruturas de horquilla no extremo 3′ da imprimación.
d.As diferenzas no valor de Tm do cebador directo e do cebador inverso non deben ser superiores a 1 ℃ e o valor de Tm debe axustarse a 60 ~ 72 ℃ (recoméndase a imprimación Premier 5 para calcular o valor de Tm).
e.Non se deben incluír secuencias de cebadores adicionais que non coincidan co modelo ao calcular o valor de Tm do cebador.
f.Recoméndase que o contido de GC da imprimación sexa do 40% -60%.
g.A distribución global de A, G, C e T no cebador debe ser o máis uniforme posible.Evite usar rexións con altos contidos de GC ou AT.
h.Evitar a presenza de secuencias complementarias de 5 ou máis bases dentro do cebador ou entre dous cebadores e evitar a presenza de secuencias complementarias de 3 ou máis bases no extremo 3′ de dous cebadores.
i.Use a función NCBI BLAST para comprobar a especificidade do cebador para evitar a amplificación inespecífica.
