Transcriptase inversa M-MLV
RevScript A transcriptase inversa obtense mediante tecnoloxía de enxeñería xenética.Ten unha maior capacidade de síntese de ADNc, estabilidade térmica e límite de temperatura de reacción (ata 60 °C).O produto de ADNc sintetizado é de ata 10 kb.Mellora a afinidade dos modelos e é axeitado para a transcrición inversa de modelos de ARN con estrutura secundaria complexa ou xenes de baixa copia.
Compoñentes
| Compoñente | HC2003B (10.000 U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000 U) |
| Transcriptase inversa RevScript (200U/μL) | 50 μl | 5 × 50 μl | 1 ml |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μl | 1,25 ml | 5 ml |
Condición de almacenamento
Este produto debe almacenarse entre -25 °C e -15 °C durante 2 anos.
Definición da unidade
Unha unidade incorpora 1 nmol de dTTP a material insoluble en ácido en 10 minutos a 37 °C usando Oligo(dT) como cebadores.
Configuración de reacción
1.Desnaturalización do molde de ARN (Este paso é opcional, a desnaturalización do molde de ARN axuda a abrir as estruturas secundarias, o que mellorará o rendemento da primeira cadea de ADNc).
| Compoñentes | Volume (μl) |
| DdH libre de RNase2O | Ata 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) ou cebador aleatorio (50 μmol/L) Ou cebadores específicos de xenes (2 μmol/L) | 1 |
| ou 1 | |
| ou 1 | |
| Modelo de ARN | X a |
Notas:
1) a: ARN total: 1-5 ug ou ARNm: 1-500 ng
2) Incubar a 65 °C durante 5 minutos, despois transferir a xeo inmediatamente para arrefriar durante 2 minutos.Centrifugación breve para recoller o líquido de reacción, engade a solución de reacción de transcrición inversa como se mostra na seguinte táboa.Pipeta suavemente para mesturar.
1.Preparación da mestura de reacción (20 μL de volume)
| Compoñentes | Volume (μl) |
| Mestura do paso anterior | 13 |
| 5 × Buffer | 4 |
| Mestura de dNTP (10 nmol/L) | 1 |
| Transcriptase inversa (200 U/μL) | 1 |
| Inhibidor de RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Realice a reacción nas seguintes condicións:
| Temperatura (°C) | Tempo |
| 25 °Ca | 5 min |
| 42 °Cb | 15-30 min |
| 85 °Cc | 5 min |
Notas:
1) a.Só é necesario incubar a 25 °C durante 5 minutos para usar os hexámeros aleatorios.Omita este paso cando use Oligo (dT)18ou Gene Specific Primer.
2) b.A temperatura recomendada de transcrición inversa é de 42 °C. Para modelos con estruturas secundarias complicadas ou alto contido de GC, recoméndase aumentar a temperatura de reacción a 50-55 °C.
3) c.Quentando a 85 °C durante 5 minutos para inactivar a transcriptase inversa.
4) O produto pódese usar directamente en reaccións de PCR ou qPCR, ou almacenarse a -20 °C para almacenamento a curto prazo.Recoméndase aliguot os produtos e almacenalos a -80 ° C para almacenamento a longo prazo.Evite a conxelación-desconxelación frecuente.
5) O produto é axeitado para a RT-qPCR dun paso, recoméndase engadir 10-20 U de transcriptase inversa por cada sistema de reacción de 25 μL ou aumentar gradualmente a cantidade de transcriptase inversa segundo a situación real.
Notas
1.Mantén limpa a zona experimental;Deben usarse luvas e máscaras limpas durante a operación.Todos os consumibles utilizados no experimento deben estar libres de RNase para evitar a contaminación por RNase.
2.Todos os procedementos deben realizarse en xeo para evitar a degradación do ARN.
3.Recoméndase mostras de ARN de alta calidade para garantir unha alta eficiencia da transcrición inversa.
4.Este produto é só para uso de investigación.
5.Por favor, opere con batas de laboratorio e luvas desbotables, para a súa seguridade.
