Enzima de tapa do virus da vacina

O encima de tapa do virus Vaccinia deriva dunha cepa recombinante de E. coli que leva os xenes para o encima Vaccinia.Este único encima está composto por dúas subunidades (D1 e D12) e ten tres actividades enzimáticas (ARN trifosfatase e guanililtransferase pola subunidade D1 e guanina metiltransferase pola subunidade D12).A enzima de tapa do virus Vaccinia é eficaz para catalizar a formación da estrutura de tapa, que pode unir especificamente a estrutura de tapa de 7-metilguanilato (m7Gppp, Cap 0) ao extremo 5′ do ARN.A estrutura da tapa (Cap 0) xoga un papel importante na estabilización, transporte e tradución do ARNm en eucariotas.Capturar o ARN mediante reacción enzimática é un método eficaz e sinxelo que pode mellorar significativamente a estabilidade e tradución do ARN para a transcrición, transfección e microinxección in vitro.

Compoñentes

Enzima de tapa do virus da vacina (10 U/μL)

10 × Tampón de tapa

Condicións de almacenamento

-25～- 15 ℃ para almacenamento (Evite ciclos de conxelación-desconxelación repetidos)

Buffer de almacenamento

Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM,

1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1 % Triton X- 100, 50 % glicerol.

Definición da unidade

Unha unidade de enzima de tapa do virus Vaccinia defínese como a cantidade de enzima necesaria para incorporar 10 pmol de GTP nun transcrito de 80 nt en 1 hora a 37 °C.

Control de calidade

Exonuclease:10U de enzima de captación do virus Vaccinia con 1 μg de ADN dixestión de λ-Hind III a 37 ℃ durante 16 horas non producen degradación como se determina mediante electroforese en xel de agarosa.

Endonuclease:10U de enzima de tapado do virus Vaccinia con 1 μg de ADN λ a 37 ℃ durante 16 horas non producen degradación como se determina mediante electroforese en xel de agarosa.

Nickase:10U de enzima de tapa do virus Vaccinia con 1 μg de pBR322 a 37 ℃ durante 16 horas non producen degradación, segundo se determina mediante electroforese en xel de agarosa.

RNase:10 U de enzima de tapado do virus Vaccinia con 1,6 μg de ARN MS2 durante 4 horas a 37 ℃ non producen degradación segundo se determina mediante electroforese en xel de agarosa.

1.ADN coli:10U de Enzima de captación do virus Vaccinia cribáronse para detectar a presenza de ADN xenómico de E. coli mediante TaqMan qPCR con cebadores específicos para o locus do ARNr 16S de E. coli.A contaminación do ADN xenómico de E. coli é ≤1 xenoma de E. coli.

2.Bacteriano Endotoxina: Proba LAL, segundo a edición 2020 da Farmacopea chinesa IV, método de proba de límite de xel, regra xeral (1143).O contido de endotoxinas bacterianas debe ser ≤10 EU/mg.

Sistema de reacción e condicións

1. Protocolo de tapado (volume de reacción: 20 μL)

Este procedemento é aplicable á reacción de tapado de 10μg de ARN (≥100 nt) e pódese ampliar segundo as demandas experimentais.

I) Combina 10 μg de ARN e H2O libre de nucleasas nun tubo de microcentrífuga de 1,5 ml ata un volume final de 15,0 μL.*10 × Tampón de tapa: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Quenta a 65 ℃ durante 5 minutos seguido dun baño de xeo durante 5 minutos.

3) Engade os seguintes compoñentes na orde especificada

*10 × Tampón de tapa: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Incubar a 37 °C durante 30 minutos, o ARN agora está tapado e listo para aplicacións posteriores.

2. Terminal de 5′ reacción de etiquetaxe (volume de reacción: 20 μl)

Este protocolo está deseñado para marcar ARN que contén un trifosfato de 5' e pódese ampliar segundo as demandas.A eficacia da incorporación da etiqueta verase afectada pola relación molar de ARN: GTP, así como o contido de GTP nas mostras de ARN.

1) Combina a cantidade adecuada de ARN e H2O libre de nucleasas nun tubo de microcentrífuga de 1,5 ml ata un volume final de 14,0 µl.

2) Quenta a 65 ℃ durante 5 minutos seguido dun baño de xeo durante 5 minutos.

3) Engade os seguintes compoñentes na orde especificada.

** GTP MIX refírese a GTP e a un pequeno número de marcadores.Para a concentración de GTP, consulteá nota 3.

4) Incubar a 37 °C durante 30 minutos, o extremo 5′ do ARN agora está etiquetado e listo para abaixo.

Aplicacións

1. Captura do ARNm antes dos ensaios de tradución/tradución in vitro

2. Marcación do extremo 5´ do ARNm

Notas sobre o uso

1.O quecemento da solución de ARN antes da incubación co encima Vaccinia Capping elimina a estrutura secundaria no extremo 5 da transcrición.Amplíe o tempo a 60 minutos para as transcricións con 5 extremos moi estruturados coñecidos.

2. O ARN usado para as reaccións de tapado debe ser purificado antes do seu uso e suspendido en auga sen nucleases.EDTA non debe estar presente e a solución debe estar libre de sales.

3. Para marcar o extremo 5´, a concentración total de GTP debería ser de 1 a 3 veces a concentración molar de ARNm na reacción.

4. O volume do sistema de reacción pódese aumentar ou baixar segundo o real.