PNGase F
O péptido-N-glicosidase F (PNGase F) é o método enzimático máis eficaz para eliminar case todos os oligosacáridos ligados a N das glicoproteínas.A PNGase F é unha amidase, que escinde entre os residuos máis internos de GlcNAc e asparaxina de oligosacáridos ricos en manosa, híbridos e complexos de glicoproteínas ligadas a N.
Aplicación
Este encima é útil para eliminar os residuos de carbohidratos das proteínas.
Elaboración e especificación
| Aparición | Líquido incoloro |
| Pureza proteica | ≥95 % (de SDS-PAGE) |
| Actividade | ≥500.000 U/ml |
| Exoglicosidase | Non se puido detectar ningunha actividade (ND) |
| Endoglicosidase F1 | ND |
| Endoglicosidase F2 | ND |
| Endoglicosidase F3 | ND |
| Endoglicosidase H | ND |
| Protease | ND |
Propiedades
| Número CE | 3.5.1.52(Recombinante de microorganismos) |
| Peso molecular | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Punto isoeléctrico | 8. 14 |
| pH óptimo | 7,0-8,0 |
| Temperatura óptima | 65 °C |
| Especificidade do substrato | Escisión de enlaces glicosídicos entre GlcNAc e residuos de asparaxina Fig.1 |
| Sitios de recoñecemento | Glicanos ligados a N a non ser que conteñan α1-3 fucosa Fig. 2 |
| Activadores | TDT |
| Inhibidor | SDS |
| Temperatura de almacenamento | -25 ~ -15 ℃ |
| Inactivación térmica | Unha mestura de reacción de 20 µl que contén 1 µl de PNGase F inactivase mediante incubación a 75 °C durante 10 minutos. |
Fig. 1 Especificidade do substrato da PNGase F
Fig. 2 Sitios de recoñecemento de PNGase F.
Cando os residuos internos de GlcNAc están ligados á α1-3 fucosa, a PNGase F non pode escindir os oligosacáridos ligados a N das glicoproteínas.Esta modificación é común en plantas e algunhas glicoproteínas de insectos.
Copoñentes
|
| Compoñentes | Concentración |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × Tampón desnaturalizante de glicoproteína | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definición da unidade
Unha unidade (U) defínese como a cantidade de encima necesaria para eliminar > 95 % do carbohidrato de 10 µg de RNase B desnaturalizada en 1 hora a 37 °C nun volume de reacción total de 10 µL.
Condicións de reacción
1. Disolver 1-20 µg de glicoproteína con auga desionizada, engadir 1 µl de tampón desnaturalizador de glicoproteína 10× e H2O (se é necesario) para facer un volume de reacción total de 10 µl.
2.Incubar a 100 °C durante 10 min, arrefriar con xeo.
3.Engadir 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 e mesturar.
4.Engade 1-2 µl de PNGase F e H2O (se é necesario) para facer un volume de reacción total de 20 µl e mesturar.
5.Incubar a reacción a 37 °C durante 60 min.
6.Para análise SDS-PAGE ou análise HPLC.
