ARNm Cap2'-O-metiltransferase

ARNm Cap 2´ -O-metiltransferase derivou dunha cepa recombinante de E. coli que porta o xene da ARNm Cap 2 ´-O-metiltransferase de vaccinia.Este encima engade un grupo metilo na posición 2'-O do primeiro nucleótido adxacente á estrutura de tapa no extremo 5' do ARN. O encima utiliza S-adenosilmetionina (SAM) como doador de metilo para metilar o ARN tapado (cap. -0) resultando nunha estrutura cap- 1.

A estrutura Cap1 pode aumentar a eficiencia da tradución, mellorando a expresión do ARNm en experimentos de transfección e microinxección. Este encima precisa especificamente de ARN cunha tapa m7GpppN como substrato.Non pode utilizar ARN con pN, ppN, pppN ou GpppN no extremo 5´.O ARN encapsulado pode prepararse mediante a transcrición in vitro utilizando un análogo de tapa ou mediante a tapa enzimática usando o Enzima de Capa Vaccinia.

Compoñentes

ARNm Cap 2'-O-metiltransferase (50U/μL)

10 × Tampón de reacción de tapa

Almacenamento

-25 ～- 15 ℃ para almacenamento (Evite ciclos de conxelación e desconxelación repetidos)

Buffer de almacenamento

20 mM de Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 0, 1 mM de EDTA, 0, 1 % de Triton X- 100, 50 % de glicerol.

Definición da unidade

Unha unidade defínese como a cantidade de encima necesaria para metilar 10 pmoles de 80 nt de transcrición de ARN encapsulado en 1 hora a 37 °C.

Ensaios de control de calidade

Exonuclease: 50 U de ARNm Cap 2 ´ -O-metiltransferase con 1 μg de ADN dixestión de λ-Hind III a 37 ℃ durante 16 horas non producen degradación segundo se determina mediante electroforese en xel de agarosa.

Endonuclease: 50 U de ARNm Cap 2 ´ -O-Metiltransferase con 1 μg de λDNA a 37 ℃ durante 16 horas non producen degradación como se determina mediante electroforese en xel de agarosa.

Nickase: 50U de ARNm Cap 2 ´ -O-Metiltransferase con 1 μg de pBR322 a 37 ℃ durante 16 horas non producen degradación como se determina mediante electroforese en xel de agarosa.

RNase: 50U de ARNm Cap 2 ´ -O-Metiltransferase con 1,6 μg de ARN MS2 durante 4 horas a 37 ℃ non producen degradación como se determina pola electroforese en xel de agarosa.

E. coli ADN: 50U de ARNm Cap 2 ´ -O-metiltransferase son cribados para a presenza deE. coli ADN xenómico usando TaqMan qPCR con cebadores específicos paraE. coli locus do ARNr 16S.OE. coli A contaminación do ADN xenómico é =1E. coli xenoma.

Bacteriano Endotoxina: proba LAL, segundo a edición 2020 da Farmacopea chinesa IV, método de proba de límite de xel, regra xeral (1143).O contido de endotoxinas bacterianas debe ser = 10 EU/mg.

Sistema de reacción e condicións

1. Combina unha cantidade adecuada de ARN tapado e H2O sen RNase nun tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ata un volume final de 16,0 µL.

2. Quenta a 65 ℃ durante 5 minutos seguido dun baño de xeo durante 5 minutos.

3. Engade os seguintes compoñentes na orde especificada (para a metilación do ARN tapado

menos de 10

*10 × Tampón de reacción de tapa: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Incubar a 37 ℃ durante 1 hora (recoméndase 2 horas de incubación para o fragmento obxectivo de menos de 200 nt).

Aplicacións

Mellorar a expresión do ARNm durante os experimentos de microinxección e transfección.

Notas sobre o uso

1. Antes da reacción, o ARN debe ser purificado e disolto en auga sen nuclease, todas as solucións non deben conter EDTA e ións.

2. Recoméndase quentar o ARN da mostra a 65 ℃ durante 5 minutos antes da reacción para eliminar a estrutura secundaria no extremo 5 da transcrición.Podería estenderse ata 10 min para a estrutura complexa de terminales de 5'.