M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
A transcriptase inversa Neoscript é unha transcriptase inversa obtida mediante o cribado de mutacións do xene M-MLV da orixe e expresión do virus da leucemia murina Moloney en E.coli.O encima elimina a actividade da RNase H, ten maior tolerancia á temperatura e é axeitado para a transcrición inversa a alta temperatura.Polo tanto, é útil para eliminar os efectos desfavorables da estrutura de alto nivel do ARN e os factores non específicos na síntese de ADNc, e ten unha maior estabilidade e capacidade de síntese de transcrición inversa.O encima ten maior estabilidade e capacidade de síntese de transcrición inversa.
Compoñentes
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand Buffer (opcional)
* 5 × First-Strand Buffer non contén dNTP, engade dNTP ao preparar o sistema de reacción
Aplicación recomendada
1.qRT-PCR dun paso.
2.Detección de virus ARN.
Condición de almacenamento
-20 °C para almacenamento a longo prazo, debe mesturarse ben antes do seu uso, evitando conxelación e desconxelación frecuentes.
Definición da unidade
Unha unidade incorpora 1 nmol de dTTP en 10 minutos a 37 °C usando poli(A)•oligo(dT)25como modelo/primer.
Control de calidade
1.Pureza electroforética SDS-PAGE superior ao 98%.
2.Sensibilidade de amplificación, control de lote a lote, estabilidade.
3.Sen actividade de nuclease esóxena, ningunha endonuclease esóxena ou contaminación por exonuclease
Configuración de reacción para a primeira solución de reacción en cadea
1.Preparación da mestura de reacción
| Compoñentes | Volume |
| Oligo(dT)12-18 Primer ou Random Primera Ou cebadores específicos de xenesb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Modelo RNA | ARN total≤ 5μg;ARNm ≤ 1 μg |
| dH libre de RNase2O | Ata 10 μl |
Notas:a/b: seleccione diferentes tipos de imprimacións segundo as súas necesidades experimentais.
2.Quentar a 65 °C durante 5 minutos e arrefriar rapidamente en xeo durante 2 minutos.
3.Engade os seguintes compoñentes ao sistema anterior ata un volume total de 20 µl e mestura suavemente:
| Compoñentes | Volume (μl) |
| 5 × Tampón de primeira cadea | 4 |
| Transcriptase inversa Neoscript (200 U/μL) | 1 |
| Inhibidor de RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH libre de RNase2O | Ata 20 μl |
4. Realice a reacción de acordo coas seguintes condicións:
(1) Se se usa Random Primer, a reacción debe realizarse a 25 ℃ durante 10 minutos, e despois a 50 ℃ durante 30 ~ 60 minutos;
(2) Se se usan Oligo dT ou cebadores específicos, a reacción debe levarse a cabo a 50 ℃ durante 30 ~ 60 minutos.
5.Quenta a 95 ℃ durante 5 minutos para inactivar a transcriptase inversa Neoscript e finalizar a reacción.
6.Os produtos de transcrición inversa pódense usar directamente na reacción de PCR e na reacción de PCR cuantitativa de fluorescencia, ou almacenarse a -20 ℃ durante moito tempo.
PCR Racción:
1.Preparación da mestura de reacción
| Compoñentes | Concentración |
| 10 × PCR Buffer (sen dNTP, sen Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM cada dNTP) | 200 μM |
| MgCl 25 mM2 | 1-4 mm |
| ADN polimerase Taq (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Cebador 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Cebador 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Modeloa | ≤10% solución de primeira reacción en cadea (2 μl) |
| ddH2O | Ata 50 μl |
Notas:a: Se se engade demasiada solución de primeira reacción en cadea, a reacción de PCR pode inhibirse.
2.Procedemento de reacción de PCR
| Paso | Temperatura | Tempo | Ciclos |
| Pre-desnaturalización | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Desnaturalización | 95 ℃ | 10-20 seg | 30-40 |
| Recocido | 50-60 ℃ | 10-30 seg | |
| Extensión | 72 ℃ | 10-60 seg |
Notas
1.Adecuado para a optimización da temperatura de transcrición inversa no rango de 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Ten unha mellor estabilidade, é axeitado para a amplificación de transcrición inversa a alta temperatura.Ademais, é favorable para atravesar de forma eficiente rexións estruturais complexas de ARN.Ademais, isoé adecuado para a detección cuantitativa de RT-PCR por fluorescencia múltiple dun paso.
3.Boa compatibilidade con varios encimas de amplificación da PCR e é axeitado para reaccións de RT-PCR de alta sensibilidade.
4.Adecuado para a reacción cuantitativa RT-PCR de fluorescencia dun paso de alta sensibilidade, mellora eficazmente a taxa de detección de baixa concentración de modelos.
5.Adecuado para a construción de bibliotecas de ADNc.
