KIT ELISA de ARN de dobre cadea (ARNdc).

Este kit é un ensaio de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) con sistema biotina-estreptavidina, para a medición cuantitativa de ARNdb cunha lonxitude superior a 60 pares de bases (pb), independentemente da secuencia.A placa foi recuberta previamente con anticorpo anti-dsRNA.Engádese ARNdb presente na mostra e únese a anticorpos revestidos nos pozos.E despois engádese anticorpo anti-dsRNA biotinilado e únese ao dsRNA da mostra.Despois do lavado, engádese HRP-Streptavidina e únese ao anticorpo anti-ARNdb biotinilado.Despois da incubación, a HRP-streptavidina non unida é eliminada por lavado.A continuación, engádese a solución de substrato de TMB e catalizase por HRP para producir un produto de cor azul que cambiou a amarelo tras engadir a solución de parada ácida.A densidade do amarelo é proporcional á cantidade obxectivo de ARNdb capturado na placa.A absorbancia mídese a 450 nm.

Aplicación

Este kit é para a medición cuantitativa do dsRNA residual.

Compoñentes do kit

Almacenamento e estabilidade

1. Para o kit non utilizado: todo o kit pódese almacenar a 2 ~ 8 ℃ durante a súa vida útil.Debe evitarse a luz forte para a estabilidade do almacenamento.

2. Para o kit usado: unha vez que se abra a microplaca, cubra os pozos non utilizados cun selado de placas e volva á bolsa de aluminio que contén o paquete desecante, sela con cremallera a bolsa de aluminio e volva a 2 ~ 8 ℃ o antes posible despois do uso.Outros reactivos deben ser devoltos a 2 ~ 8 ℃ o antes posible despois do seu uso.

Materiais necesarios pero non subministrados

1. Lector de microplacas con filtro de 450±10nm (mellor se pode detectar a 450 e 650 nm de lonxitude de onda).

2. Agitador de microplacas.

3. Puntas e tubos de centrífuga sen RNase.

Diagrama de fluxo de operacións

Antes de Comezar

1. Leve todos os compoñentes e mostras do kit a temperatura ambiente (18-25 ℃) antes do uso.Se o kit non se usa nunha soa vez, retire só tiras e reactivos para o presente experimento e deixe as tiras e reactivos restantes nas condicións necesarias.

2. Tampón de lavado: dilúe 40 mL de tampón de lavado concentrado 20× con 760 mL de auga desionizada ou destilada para preparar 800 mL de tampón de lavado 1×.

3. Estándar: xirar ou centrifugar brevemente a solución madre antes de usala.A concentración de catro patróns proporcionados é de 5 ng/μL.Para os estándares de dsRNA UTP e pUTP, dilúa a solución stock a 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL co tampón STE para trazar a curva estándar.Para os estándares de dsRNA N1-Me-pUTP, dilúa a solución stock a 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL con tampón STE para trazar a curva estándar.Para o estándar 5-OMe-UTP dsRNA, dilúa a solución stock a 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL con tampón STE para trazar a curva estándar.Recomendamos que os estándares poidan diluírse segundo os seguintes gráficos:

4. Anticorpo de detección biotinilado e solución de traballo de HRP-estreptavidina: xirar ou centrifugar brevemente a solución madre antes de usala.Dilúeos ata a concentración de traballo con tampón de dilución.

5. Subestado TMB: aspire a dosificación necesaria da solución con puntas esterilizadas e non volva a verter a solución residual no frasco.O subestado de TMB é sensible á luz, non expoña o substrato de TMB á luz durante moito tempo.

Usando protocolo

1. Determine o número de tiras necesarias para o ensaio.Insira as tiras nos marcos para usar.As tiras de placas restantes que non se utilicen neste ensaio deben volverse embalar na bolsa con desecante.Pecha ben a bolsa para almacenala no frigorífico.

2. Engadir 100μL de cada unha das dilucións de patrón, branco e mostras nos pozos axeitados.Cubra co sellador de placas.Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 500 rpm.As mostras deben diluírse con tampón STE ata a concentración adecuada para un ensaio preciso.

3. Paso de lavado: aspirar a solución e lavar con 250μL de tampón de lavado a cada pozo e deixar repousar durante 30 segundos.Desbotar completamente o tampón de lavado encaixando a placa sobre papel absorbente.Lavar totalmente 4 veces.

4. Engade 100μL de solución de traballo de anticorpos de detección biotinilados en cada pozo.Cubra co sellador de placas.Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 500 rpm.

5. Repita o paso de lavado.

6. Engade 100μL de solución de traballo de HRP-estreptavidina en cada pozo.Cubra co sellador de placas.Incubar durante 30 min a temperatura ambiente con agitación a 500 rpm.

7. Repita o paso de lavado de novo.

8. Engade 100μL de solución de substrato de TMB a cada pozo.Cubra co sellador de placas.Incubar 30 min a TA Protexer da luz.O líquido volverase azul coa adición de solución de substrato.

9. Engade 50μL de solución de parada en cada pozo.O líquido volverase amarelo pola adición de solución de parada.A continuación, executa o lector de microplacas e realiza a medición a 450 nm inmediatamente.

Cálculo de Resultados

1. Fai unha media das lecturas duplicadas para cada patrón, control e mostra e resta a densidade óptica estándar cero media.Constrúe unha curva estándar con absorbancia no eixe vertical (Y) e concentración de ARNdc no eixe horizontal (X).

2. Recoméndase realizar o cálculo cun programa informático de axuste de curvas como Curve Expert 1.3 ou ELISA Calc nun modelo de axuste non lineal de 5 ou 4 parámetros.

Rendemento

1. Sensibilidade:

límite inferior de detección: ≤ 0,001 pg/μL (para UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (para 5-OMe-UTP-dsRNA).

límite inferior de cuantificación: 0,0156 pg/μL (para UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (para N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (para 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precisión: CV de Intra-ensaio ≤10%, CV de Inter-ensaio ≤10%

3. Recuperación: 80% ~ 120%

4.Linealidade: 0,0156-0,5 pg/μL (paraUTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (para N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (para 5-OMe-UTP-dsRNA).

Consideracións

1. A temperatura e o tempo de reacción TMB son críticos, controlaos de acordo coas instrucións estrictamente.

2. Para conseguir unha boa reproducibilidade e sensibilidade do ensaio, é esencial un lavado adecuado das placas para eliminar o exceso de reactivos sen reaccionar.

3. Todos os reactivos deben ser mesturados completamente antes do seu uso e evitar bombóns durante a adición de mostra ou reactivos.

4. Se se formaron cristais no tampón de lavado concentrado (20x), quenta a 37 ℃ e mestura suavemente ata que os cristais estean completamente disoltos.

5. Evite o ensaio de mostras que conteñan azida de sodio (NaN3), xa que podería destruír a actividade de HRP, dando lugar a unha subestimación da cantidade de ARNdb.

6. Evite a contaminación da RNase durante o ensaio.

7. O estándar/mostra, o anticorpo de detección e o SA-HRP tamén se poden realizar a temperatura ambiente sen axitar, pero isto pode provocar que a sensibilidade de detección diminúa unha vez.Para este caso, recomendamos que os estándares de ARNdb UTP e pUTP se dilúan a partir de 2 pg/μL, os estándares de ARNdb N1-Me-pUTP a partir de 4 pg/μL e o estándar de ARNdb 5-OMe-UTP a partir de 8 pg/μL.Ademais, incube a solución de traballo de HRP-estreptavidina durante 60 min a temperatura ambiente.Non use o agitador de matraz, porque o agitador de matraz pode producir resultados inexactos.

Resultado típico

1. Datos da curva estándar

2. Cálculo da curva estándar

3. Rango de detección do revestimento: 0,0312- 1pg/μL